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【科研进展】先进院科研攻关,让蛋白质结晶技术从难到简

时间:2020-12-10        来源:

第六期科普时,我们已经介绍了蛋白质晶体。


查看蛋白质晶体科普——【趣味科普】第六期:为抗击疫情立下大功的蛋白质晶体,到底是什么?


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大尺寸SARS-CoV-2蛋白酶晶体,大约2×0.8×0.2 mm,0.3 mm3,用于中子和X射线衍射数据收集。


01

让蛋白质结晶意义重大


对“静止”的蛋白质进行观察,很多“疑难杂症”都能浮出水面,蛋白质晶体对于生命科学的研究具有重大意义。以今年年初爆发的新型冠状病毒(2019-nCoV)为例,我国科学家就是利用病毒的水解酶与抑制剂的复合物晶体成功解析了原子结构,可为抗病毒药物的快速筛选和研发提供有力的工具。截止2020年1月1日,蛋白质数据库收录了超过16万个蛋白质晶体的原子结构信息,已经渗透到了众多领域,如药学,医学,农业,材料学等。目前,有9位科学家因解析蛋白质的晶体结构而获得诺贝尔奖。然而,让蛋白质结晶可不是一件容易的事情。


在太空中生长的人胰岛素晶体


在科学界,蛋白质晶体的生长常常被认为是“艺术”远多于“科学”,甚至有许多科学家为了晶体更好地结晶,开始有些“小迷信”:比如把做好的结晶板放在车上开出去几个小时,或是在晶体实验柜门上贴了两只大恐龙贴纸……其实,这些“小迷信”都反映出:蛋白质晶体的结晶过程受到很多因素的影响,能够有一颗完整的结晶是一件很困难的事情。想要获得足够质量的晶体,尤其对新颖的、表征不佳的基因产物来说,通常是新结构测定项目中最困难也是最耗时的步骤。


02

蛋白质结晶技术发展的艰难历程


科学家们研究蛋白质结晶技术花费了很长时间。1988年诺贝尔化学奖被授予三位德国科学家,原因是三个人通力合作,在世界上首次解析了一种膜蛋白——菌光合反应中心的高分辨率三维结构,它拉开了膜蛋白结构生物学的序幕,在生物学界影响非常大。之后,科学家们在基因组学和蛋白质组学领域不断取得新进展,可以作为潜在靶向药物的蛋白质的数量呈指数级增加,然而这些方法获得有用晶体的成功率不足20%。


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药物靶标G蛋白偶联受体(GPCR)晶体


2011年,英国帝国理工学院和萨里大学的科学家们使用一种“分子印迹聚合物(MIPs)”的材料,研发出了一种更有效的制造蛋白质晶体的方法。但是这种方法在结晶条件成分复杂,包含高盐,有机溶剂,宽泛的酸碱区间等条件下,容易造成MIPs对蛋白质的印记作用失效。科研不断深入,技术不断迭代,目前,应用最为广泛的晶体制备方法当属规模筛选,比如高通量蛋白质结晶筛选,即从成百上千个溶液条件中筛选出适合结晶的条件。据相关数据显示,目前的高通量蛋白质结晶筛选的成功率仅为15.6%,严重制约了蛋白质结晶技术在结构生物学领域的应用和发展。缺乏高效、广谱的蛋白晶体制备技术是目前结构生物学研究中的技术瓶颈。


近期,由中国科学院深圳先进技术研究院喻学锋研究员课题组研发的一种蛋白质结晶筛选添加剂——人工晶种混悬液打破了技术桎梏。新法的应用,能够让蛋白质晶体的结晶更简便,更科学,更完整。


03

先进院新技术提升蛋白质结晶成功率


100多年前,吉布斯等人提出“经典成核理论”,结晶过程是一些分子或原子偶然聚集在一起,碰巧以结晶形式排列,然后其他分子(原子)逐个附着,形成更大的结晶相,该结论得到了学术界广泛认可。


然而,经典成核理论也有诸多缺点,它表明蛋白质晶体的成核并不是沿着经典路线而是更复杂的路线进行的,即两步法成核理论。第一步是形成足够尺寸的溶质分子团簇,第二步是团簇重新排列形成有序结构。目前的实验和理论研究,证明了两步法成核理论不仅可以应用到生物大分子(如蛋白质)上还用到了有机小分子上,表明这一机理或许会成为大部分溶液析晶过程的基础。在液滴内从无序到有序结构团簇的形成,也就是第二步,决定晶体成核速率,由于这一步中分子复杂性增加,成核的时间变长,因为高度的构象灵活性,更复杂的分子形成最佳晶格结构会更困难。

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经典成核理论与两步成核理论中吉布斯自由能随结晶过程的变化比较


传统的成核剂材料,如矿物晶体、石墨烯、多孔材料如多孔硅等都曾作为成核剂用于蛋白质结晶实验中,这些成核剂的设计主要依赖于经典的成核理论,无法适用于构象灵活性强的绝大多数蛋白质分子。针对这一难题,材料界面中心和武汉先进院团队经过不断的设计和实验验证,最终将成核剂材料设计为具有超构表面的材料。


超构材料21世纪初被提出,截至目前它仍然是非常活跃的前沿领域。其中的微结构,大小尺度与它作用的蛋白质尺寸相当,因此得以对蛋白质的结晶过程施加干预,对蛋白质的聚集态形成起到促进作用,从而降低了两步成核中的第一步能垒。其次,通过材料本体结构的晶格对聚集态蛋白质分子进行引导排列,促进蛋白质分子的有序排列和晶核形成,从而降低了两步成核中的第二步能垒。


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成核剂诱导蛋白质结晶


尽管通过实验和理论证明了超构材料在蛋白质结晶方面的巨大潜力,但要充分发挥其优势则必须兼容当前蛋白质结晶通过的高通量筛选系统。目前国际上普遍采用液体处理机器人来进行高通量结晶筛选,筛选一个结晶条件的蛋白样品消耗体积为纳升级别。因此,如何快速,稳定地将成核剂添加到高通量系统的同时,又不对结晶系统造成大的影响成为急需解决的问题。


随后通过优化生产和制备工艺,考察了各生产因素对成核剂尺寸和稳定性的影响,确定了适合高通量蛋白质结晶筛选的成核剂混悬剂的制备工艺流程。这是一种含有具有表面超结构的有机无机复合材料,其尺寸分布在几百纳米到几微米之间。该产品的组成为材料颗粒与水溶液的混悬液。在蛋白质结晶筛选实验中,使用该产品有助于提高蛋白质结晶筛选的成功率,包括改善晶体的分辨率和筛选新的结晶条件,使不结晶或难结晶的蛋白质成功结晶,展现了巨大的应用潜力,使用该成核剂已经成功结晶和解析十多个蛋白质晶体结构。


此外,针对能够结晶的蛋白质分子,成核剂混悬液在筛选新的结晶条件,提升结晶的分辨率方面同样有效。目前,先进院已经与国内超过18个实验室开展了合作,助力我国的生命科学和生物医药研究。



采写:李龙、李香君


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